2-6, 3-6 tabte serberen søndag til verdensranglistens nummer 32, Alejandro Tabilo fra Chile.
Den seksdobbelte vinder af turneringen i Rom fik en elendig start på opgøret og tabte sine to første servepartier, hvorfor det hurtigt stod 0-4 i første sæt.
Meget bedre blev det ikke i andet sæt, hvor Tabilo kom foran 40-0 i Djokovics første serveparti og siden gjorde arbejdet færdig og bragte sig foran 1-0 på sin fjerde breakbold.
Den normalt nærmest usårlige Djokovic lavede en dobbeltfejl og blev brudt for fjerde gang, da 26-årige Tabilo efter kun omkring 68 minutters spil kunne juble over karrierens hidtil største sejr.
Djokovic tager i slutningen af maj hul på sit titelforsvar ved French Open. 3 af hans 24 grandslamtitler er hentet i den franske hovedstad.
Han har i 2024 endnu ikke været i en finale, og han møder op med beskedne seks kampe på grus i bagagen efter sin tidlige exit i Rom.
Danske Holger Rune tog lørdag hul på Italian Open med en sikker sejr over Luca Nardi i anden runde. Han møder næste gang argentinske Sebastian Baez.