Guardiola sparede flere af sine stjerner i opgøret, hvor værterne med to scoringer på fem minutter afgjorde det. Fra bænken så profilerne Kevin De Bruyne og Erling Halaand deres hold komme bagud i første halvleg.
Brasilianske Lyanco stoppede efter 22 minutter et muligt City-angreb og satte i stedet i fart den anden vej.
Med et præcist indlæg fandt han sin franske holdkammerat Sekou Mara, som sparkede bolden hårdt i nettet med en veltimet inderside. City havde såmænd sine chancer, men var uden den vanlige skarphed.
Og da gæsternes målmand Stefan Ortega pludselig stod placeret langt ude af sit mål, var Moussa Djenepo vaks ved havelågen. Det var fem minutter efter føringsmålet.
Djenepo sparkede den i en kontrolleret bue over tyskeren, som nok hurtigt kunne konstatere, at han havde efterladt alt for meget plads bag sig.
Guardiola tog affære og satte tre mand ind fra anden halvlegs start. En af dem var De Bruyne, og ti minutter efter fulgte Erling Haaland.
Men Manchester City havde bare ikke dagen. Selv om holdet i perioder satte Southampton under pres, var chanceproduktionen ikke tilstrækkelig til at avancere. Med Southamptons sejr er de fire semifinalister nu på plads.
Samtidig spillede Nottingham Forest sig nemlig videre med en sejr i straffesparkskonkurrence over Wolverhampton. Manchester United og Newcastle blev klar til semifinalerne tirsdag.